超分解能時間分解型共焦点蛍光顕微鏡 MicroTime 200 STED

MicroTime 200 STED 超分解能を備えた時間分解共焦点蛍光顕微鏡

倒立顕微鏡本体に基づく完全な共焦点STEDシステム
50nm未満の光学分解能
640 nmでの励起、およびオプションで595nmと660nmでの追加レーザーによる励起
SPADまたはHybrid-PMTを使用した最大6つの真の並列検出チャネル
ゲート付きSTED（gSTED）およびgSTED-FCSをサポート
2Dおよび3D（寿命）イメージングと正確なポイントポジショニングのためのピエゾスキャン
高度で使いやすいデータ取得および分析ソフトウェアSymPhoTime64
AFM / FLIM / STED同時測定のアップグレードオプション
MicroTime 200で利用可能な他のすべてのメソッド、つまりFLIM、FCS、FCCS、FLCS、FRETなどをサポートします。
スキャン速度に優れた柔軟性と優れた空間精度を備えたFLIMbeeガルボスキャナーアドオン
FLIMbeeガルボスキャナーを使用したxのラインスキャンで利用可能なFCSのスキャン

近年、超解像顕微鏡法がますます注目を集めています。現在では開発段階を超えて進化しており、以前は光の回折限界によって隠されていた生物学的システムを調査することができます。超解像イメージングの最も一般的な手法の1つは、誘導放出抑制（STED）顕微鏡法です。 STEDは通常、共焦点顕微鏡で実行されるため、MicroTime 200に追加するのに最適です。システムへのSTEDの統合は、最高の堅牢性と使いやすさを目指しています。このシステムでは、システムを変更し、オープン顕微鏡プラットフォームMicroTime 200の全機能を使用することを選択しながら、長いアライメント準備なしでSTED顕微鏡を実行できます。

50nm未満の光学分解能

STED顕微鏡は、誘導放出減退の原理を利用している。レーザーの焦点で蛍光体を励起した後、より波長の長いレーザーのドーナツ状の第2の焦点を使用して、刺激放出によって周辺の分子を積極的に脱励起します。MicroTime 200 STEDでは、EASYDOnutと呼ばれる位相板を用いてドーナツを作成します。このプレートはビームパスに挿入され、STEDレーザーの焦点をドーナツ型に変えますが、励起レーザーには影響を与えません。
このシンプルな実装により、同じ光ファイバーから発生する2つのレーザービームの空間アライメントが不要になり、50nm未満の空間分解能が得られます。 MicroTime 200 STEDの時間分解データ取得原理により、すべての測定データにタイムゲートを適用することも可能です。このゲート付きSTED（またはgSTED）アプローチにより、イメージの分解能が向上し、FCSの観察量を削減します。

励起波長の選択

MicroTime 200 STEDの励起システムは、STEDの励起レーザーとSTEDレーザー自体を統合する専用のレーザー結合ユニットを中心に構築されています。標準の励起波長は640nmであり、オプションで595nmおよび660nmの追加レーザーと組み合わせてデュアル種STEDイメージングを行うことができます。 765 nmでのSTEDレーザーの高出力のため、機器を操作する際のユーザーの安全を確保するために特別な注意が払われました。 FLIM、FRET、FCSなどの非STEDアプリケーション用に、追加のパルスダイオードレーザーを備えた2番目のレーザー結合ユニットをシステムに取り付けることもできます。
マルチチャンネル・レーザー・ドライバーPDL 828 “Sepia II “は、レーザー出力と繰り返し周波数を柔軟に調整でき、複数のレーザーを並行して使用することも可能で、パルスインターリーブ励起（PIE）などの高度な技術を実現します。励起パルスとSTEDパルスの間の時間遅延は、最高の柔軟性と最高のSTED分解能を得るために調整可能です。

スキャン技術

MicroTime 200プラットフォームの優れた汎用性は、高精度を維持しながら、超低速から高速までの範囲のスキャン速度を提供できるFLIMbeeガルボスキャナーによって補完されます。この高度な速度の柔軟性により、リン光寿命イメージング（PLIM）からrapidFLIMを使用した高速蛍光寿命測定までのアプリケーションが可能になります。さらに、その高精度と高感度により、FLIMbeeスキャナーはSTEDを介した超解像顕微鏡法に最適であり、単一分子レベルまでのイメージングを可能にします。

FLIMbeeスキャナーを搭載したMicroTime200は、spFRET、PIE-FRET、（STED-）FCS、FLCS、FLCCS、デュアルフォーカスFCS（2fFCS）、さらには異方性測定などの単一分子検出（SMD）メソッドに適しています。。さらに、デスキャンおよびノンデスキャン解除検出を備えた2光子励起（TPE）が可能です。

FLIMbeeガルボスキャナーのコアは、直線性、再現性、低ドリフトに優れた3つの高精度な共振ミラーで構成されています。2つのY軸ガルボミラーは、レーザービームが対物レンズの入り口で静止していることを保証します。このミラー構成により、イメージフィールドのケラレを最小限に抑え、広いスキャン範囲で一定のフォーカルボリュームを確保することができます。FLIMbeeスキャナーは、100倍の対物レンズを使用した場合、10nmの最小ピクセルサイズを実現しています。

ガルボスキャナーアドオン「FLIMbee」のパンフレット

単一光子感度を持つ検出サブシステム

MicroTime 200 STEDでは、ピエゾテーブルと3Dイメージング用の高精度PiFoc素子を組み合わせることで、スキャンを容易にしています。ピエゾスキャンを採用することで、高品質なSTED画像に欠かせない高い再配置精度と安定性を実現しています。このシステムは，最大6つの個別の検出チャンネルを構成することが可能です。765nmで枯渇するSTED色素の深紅色の発光には、この波長域で最大70％の高い検出効率を持つSPADが一般的に使用されます。

ピコ秒分解能のゲートSTED

データ取得は、ピコ秒分解能のPicoQuant独自の時間タグ付き時間分解（TTTR）データ取得モードを使用した時間相関単一光子計数（TCSPC）を使用して実行されます。取得したTTTRデータは、通常のSTEDイメージングだけでなく、ゲートSTED（gSTED）測定にも使用できます。 TTTRデータ取得モードの利点は、1つの基本的なデータ形式に基づいて、FLIM、FCS、さらには同時相関（「アンチバンチング」）など、STED以外の非常に異なる測定手順を実行できることです。 TTTR形式は、PicoQuantから入手可能なすべてのTCSPC機器でサポートされています。

直感的なデータ取得と分析

MicroTime 200 STEDシステムのソフトウェアであるSymPhoTime 64は、専用のSTEDデータ取得および解析プロトコルを備えています。例えば、プリセットのタイムゲートは測定プレビューに統合されており、より高いSTED分解能のための柔軟なタイムゲートをデータ解析中に設定することができます。また、独自の蛍光パターンマッチング手法を用いて、同じSTEDレーザー波長で記録されたデータから複数の種を分離することができます。

FLIM, FRET, FCS, その他

MicroTime 200 STEDは、STEDおよびSTED-FCSを実行するために使用できるだけでなく、MicroTime 200で利用可能な他のすべての測定および分析手順をサポートしています。これには、FLIM、FCS、FCCS、

仕様

光学分解能	50 nm　未満 (STED) 300 nm 未満(共焦点)
励起システム	コンパクトなレーザー結合ユニット内で最大80MHzの繰り返し周波数を持つピコ秒ダイオードレーザー（375 nm – 900 nm）シングルまたはマルチチャンネルレーザードライバーオプション：266nmまでの励起* オプション：外部レーザー（例：チタン：サファイアレーザー） STED用 640 nm (励起)、765 nm (STEDレーザー) 。 640nmと595nmの励起による二種のSTED 640nmと660nmの励起による二種のSTED
顕微鏡	オリンパスの倒立顕微鏡IX73またはIX83 共焦点顕微鏡用に特別に設計された右側のポート左側のポートと背面のポートには引き続きアクセスできます（広視野イメージングやTIRFなど）トランスミッション照明ユニットが含まれています 25mm範囲の特別な手動サンプルポジショニングステージ 20 mm x 20mmカバースリップ用の標準サンプルホルダーオプション：落射蛍光照明オプション：低温測定用のクライオスタットオプション：原子間力顕微鏡（AFM）との組み合わせ
対物レンズ	倍率20倍および40倍の空気対物レンズ（標準）利用可能なさまざまなハイエンド対物レンズ（油/水浸、空気間隔、IR / UV強化、TIRF、または長作動距離対物レンズ）
スキャン	ピエゾ: コンピューター制御公称1nmの測位精度で80µm x 80 µmのスキャン範囲を使用した2次元ピエゾ対物レンズスキャン 3次元イメージング用のPIFOC、公称1nmの測位精度で80µmの範囲オプション：サンプルスキャンオプション：cmスキャン範囲の大面積スキャンテーブルガルバノスキャナー FLIMbee: 画像サイズ：10×10～2048×2048ピクセル最大の視野。250 × 250 µm (60倍対物レンズ) 最大2.6 kHzのライン周波数（双方向スキャン）、5.2 FPS @ 512 × 512 pixel オプションのz軸制御、例えばz-stack用（ピエゾベース、最大100 µm）ピクセルの滞留時間：0.5 µs～1 s
メイン光学ユニット	コンパクトな筐体に最大4つの並列検出チャンネルを搭載した共焦点検出器安定性を高めたハイエンドのメジャーダイクロイックを採用すべての光学部品は簡単にアクセス、調整、交換可能ビーム診断用のCCDカメラと相対パワー測定用のフォトダイオード可変ビームスプリットユニット、外部機器接続用出口ポート
検出器	単一光子アバランシェダイオードハイブリッド-光電子増倍管
データ取得	独自の時間タグ付き時間分解（TTTR）測定モードでの時間相関単一光子計数（TCSPC）の方法に基づく最大6チャネルの同時データ取得
ソフトウェア	SymPhoTime 64