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単一光子検出共焦点蛍光顕微鏡 Luminosa
単一光子検出共焦点蛍光顕微鏡。最高のデータ品質と使い易さを兼ね備えた蛍光顕微鏡です。自動化により測定時間を短縮を実現。研究所・実験室に簡単に設置いただけます。
単一光子検出共焦点蛍光顕微鏡 Luminosaの概要
単一光子検出共焦点蛍光顕微鏡 Luminosaは、最高のデータ品質と日々の運用で役立つ極めてシンプルな操作性を兼ね備えています。研究者の実験室に簡単にインストール可能。時間分解の蛍光寿命イメージングを検討し始めたビギナーから、経験豊かなエキスパートまで、幅広いユーザーにとって、最も時間効率が良く、誰もが頼れる顕微鏡システムです。
単一光子検出共焦点蛍光顕微鏡 Luminosa のメリット 特長
最も信頼性の高い品質と精度
あらゆる測定状況での単一分子研究に最適なパフォーマンス。サンプルの有無に関わらず、ワンクリックの自動アライメント手順。同じ顕微鏡でのガルバノ スキャン (最大速度) と対物スキャン (最大光子検出効率)を搭載。時間を短縮しサンプル解析に集中可能
コンテキストベースの直感的なワークフローにより、smFRET、FCS、FLIM の測定を効率的にデータ取得できます。測定結果は最小限のユーザー操作で取得できます。GPU ベースのアルゴリズムは、高速で信頼性の高い結果を提供します。高度な柔軟性
ワンクリックで FCS および smFRET分析のダイナミクスに合わせて観察範囲を調整します。ソフトウェアを介してすべてのオプトメカニクスコンポーネントにアクセスできるオープンモードの操作が可能です。 |  |  |
| マウス胚組織の自家蛍光 | 染色された神経細胞1 | 神経細胞(プレシナプスのBassoonと ポストシナプスのHomerクラスター) |
 |  |  |
| マウス胚組織の自家蛍光2 | 染色された神経細胞2 | 神経細胞（プレシナプスのBassoonと ポストシナプスのHomerクラスター）2 |
Luminosa 単一光子検出共焦点蛍光顕微鏡の対応測定法
Luminosaは下記の方式の測定が可能です。
蛍光寿命イメージング（FLIM）
FLIMは、個々の蛍光体の発光スペクトルではなく、蛍光寿命を分解して表示する蛍光イメージング技術である。蛍光寿命は、分子が励起状態から光子を放出して基底状態に戻るまでの平均時間として定義される。蛍光寿命は濃度、サンプルによる吸収、サンプルの厚さ、光溶出、励起強度とは無関係であるため、FLIMは強度に基づく方法よりも人為的な影響を受けにくい特徴があります。
FLIMのメリット
- 蛍光色素の区別に使用できる。
- 新たな次元の情報が得られる
- スペクトル情報を補完する
- 蛍光体の寿命は、pH、イオン濃度、酸素濃度、分子結合などの環境パラメータに影響されることがあるため、多くの種類の機能イメージングに適した手法です。
寿命ベースフェルスター共鳴エネルギー移動法（FLIM-FRET）
FRETは非放射過程であり、励起された蛍光分子（ドナー）からのエネルギーが、2-10nmの範囲で近くの非励起蛍光体（アクセプター）に移動します。エネルギー移動の結果、ドナーは消光し、2つの蛍光体の蛍光強度が変化し、ドナーの寿命のみが短くなります。FLIM-FRETのメリット
寿命ベースのFRETは、異なるFRET効率を持つ異なるサブ集団を同定することが可能になります。
単一分子フェルスター共鳴エネルギー移動法（smFRET）
この種の実験では、FRET過程は単一分子内（ドナーとアクセプターを持つ）や、共焦点容積を自由に拡散して表面に固定化された相互作用パートナー間で観察されます。smFRETに非常に有用な技術として、複数のパルスレーザーを同期させたパルスインターリーブ励起（PIE）があります。レーザーパルスはナノ秒の時間スケールで分離され、サンプル分子の時間的挙動を同時に記録することが可能にします。smFRET実験では、これによりドナーとアクセプターを交互に励起することが可能になります。このようにして、アクセプター色素はFRETプロセスとは独立して励起され、存在と光活性を確認することが可能になります。活性なドナーまたはアクセプターを持たない分子は、活性なFRET複合体から分離さ れ、活性なFRET複合体から分離された分子は、活性なFRET複合体から分離されます。これにより、FRET効率が非常に低いFRET分子であっても、アクセプターが存在しない分子や蛍光を発しない分子と区別することが可能になります。
参考文献：PhotonicsViews（2023年2月／3月号）掲載記事（外部英文ページに遷移）合理化されたsmFRET実験についてご覧いただけます。
蛍光相関分光法（FCS）
蛍光相関分光法（Fluorescence Correlation Spectroscopy: FCS）は、蛍光強度の時間的ゆらぎの相関分析です。この特徴的なゆらぎの原因となる光物理学や、検出された粒子の拡散挙動や絶対濃度に関する洞察を得られます。FCSは、粒子（分子）の濃度やサイズ、形状、環境の粘度といった重要な生化学的パラメーターの決定を可能にします。
蛍光寿命相関分光法（FLCS）
蛍光寿命相関分光法（FLCS）は、ピコ秒時間分解蛍光検出を用いて、異なるFCS寄与を分離する方法です。
FLCSは、スペクトルのクロストークやバックグラウンドを除去できるため、蛍光相互相関分光法（FCCS）に寿命の異なるスペクトル分離不可能な蛍光色素を使用する場合に特に優れています。また、検出器のアフターパルスアーチファクトを回避することもできます。
蛍光相互相関分光法 （FCCS）
蛍光相互相関分光法（FCCS）は、2つの異なる物質からのFCSシグナルを、それらの異なる発光スペクトルに基づいて識別します。
異方性イメージング（Anisotropy）
蛍光異方性の定常状態、特に時間分解蛍光異方性の測定は、分子の配向や移動度、またそれらに影響を与える過程を研究する上で、非常に興味深い可能性を秘めています。蛍光異方性の定常状態、特に時間分解蛍光異方性の測定は、分子の配向や移動度、またそれらに影響を与える過程を研究する上で、非常に興味深い可能性を持っています。一般的に、異方性は蛍光色素の濃度に依存せず、検出されるシグナル強度に依存しません。これは、蛍光体の移動度が共鳴伝達効率に影響を与える可能性のあるsmFRET測定の解釈にとってとりわけ重要です。時間分解異方性測定では、定常状態は時間平均値を測定するだけで、プロセスのダイナミクスを直接知ることができませんが、より有益な情報が得ることができます。
PAINTとdSTORMによる超分解能FLIM用に変更されたカスタマイズモード
Luminosaは、測定法開発のためにカスタマイズされたモードを用意しています。このモードでは、すべてのオプトメカニカルコンポーネントにソフトウェアから完全にアクセスでき、パラメータを自由に選択することができます。このモードを利用して、標準的なFLIMを超える超分解FLIMを実現することが可能になりました。一方では、フリブール大学のGuillermo P. Acunaの研究グループと協力してFLIM-PAINTイメージングが行われ、他方では、ゲッティンゲン大学のJörg Enderleinのグループと協力してFLIM-dSTORMイメージングが行われました。
単一分子局在顕微鏡（SMLM）は、個々の分子の位置を順次特定し、その後に超解像度画像を組み立てることによって、回折限界を超える空間分解能を持つ画像を得ることができます。分子を明状態と暗状態の間で切り替えて、画像フレームごとに少数のサブセットのみの局在化を可能にするさまざまなメカニズムが用意されています。そのひとつは、DNA-PAINT（DNA Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography：局在化技術に基づいた超解像顕微鏡法）であり、短く蛍光標識したオリゴヌクレオチドを使い、相補的な標的となるDNA分子に一過性に結合さ せます。もう一つの方法はdSTORM（direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy：超解像顕微鏡法）で、ここでは蛍光色素が点滅する、つまり確率的にスイッチが入り、発光し、すぐに暗黒状態に 戻るというものです。
共焦点イメージングでは、スキャニングエリア、ピクセル数、ピクセル滞留時間が、画像1枚あたりの撮影時間を決定します。PAINTの場合、この時間はDNA-PAINTイメージャー鎖の結合速度に合わせる必要があるため、撮影時間は平均結合時間よりもかなり短くなります。dSTORMの場合は、蛍光色素の点滅速度に応じて取得時間を調整する必要があります。
結果として得られた一連の共焦点FLIM画像を、SMLM測定で通常行われるように解析して、最終的な超解像度の画像を入手することができます。最後に、各1分子イベントの光子到達時間を取得し、寿命コントラストを得るために解析を行うことができます。
FLIM-SMLMのメリット
- PAINTまたはdSTORMによる空間超分解能
- 共焦点切片の作成能力
- マルチプレキシングやFRETのためのFLIMによるライフタイムコントラストの追加
- 単一の励起レーザーで従来の市販顕微鏡を使用可能
- 長時間測定のためのホールドフォーカスオプション
FLIM-PAINTについてもっと知りたい方は、こちら（英文ページ遷移）をお読みください。
Luminosaアプリケーション事例
※オプションを組み合わせたアプリケーション事例はこちら
単一分子レベルでの動的構造生物学
相分離がもたらす細胞メカニズム
蛍光法は、相分離のキネティックス研究、分子の異なる相への分配の追跡、相分離した相のダイナミクスの観察、相分離した相の異なる特性の研究に用いることが可能。FCSは標識種の濃度を測定し、その拡張であるFCCSとFLCSは複数の種の濃度を同時に測定することもできる。さらに、FCSは研究対象の分子の拡散速度を測定し、これは各相で異なる場合もある。蛍光異方性実験は、局所環境の粘性や剛性に依存する分子の回転運動を観察することで、FCSをうまく補完します。蛍光センサーのFLIMは、pH、温度、膜張力、様々なイオン濃度などの環境パラメータをリアルタイムで読み取ることができる。このような新たな次元の情報は、異なる相の動態を解析し、特性を物理的観点から理解するのに役立ちます。環境センシング
分子クラウディング、pHの変動、細胞膜の変化など、細胞内のタンパク質本来の環境の特性は、その機能に影響を与える。しかし、多くの場合、これらのパラメーターのすべてがわかっているわけではないので、実験で正確に再現することはできない。近年、特定の環境変化（例えば温度、カルシウム濃度、グルコース濃度、膜張力など）に反応して蛍光寿命を変化させるさまざまな蛍光センサーが開発されている。FLIMでは、これらのパラメーターを生きた細胞から非侵襲的な方法でリアルタイムに定量的に読み取ることができ、タンパク質の機能や制御をよりよく理解するための情報を入手することが可能です。細胞膜の動態と構造のマッピング
相補的な蛍光メソッドを組み合わせることで、異なるアングルから生体膜にアプローチすること可能です。植物の構造研究を開発
葉のクロロフィルや木質細胞壁のリグニンやフラボノイドなど、多くの植物成分は強い自家蛍光を示す。FLIM を使えば、蛍光寿命パターンが異なる蛍光ラベルからのシグナルも、自家蛍光バックグラウンドから容易に分離することができる。植物のライブイメージングにより、例えば、組織パターン形成、細胞仕様、分裂に関する新たな知見を得ることができる。細胞レベルでは、FLIM-FRETはタンパク質の局在、動態を決定し、相互作用を定量化することができる。FCSは、タンパク質の動きや濃度を定量化し、オリゴマー化を検出する補完的な手法になります。Luminosaにオプションを組み合わせたアプリケーション事例
Luminosaでは、いくつかの追加オプションが利用可能で、空間分解能の向上、代謝イメージング、またはライブセル実験の拡張など、システムの機能をさらに拡張することができます。
PDA-23検出: SPADアレイによる共焦点時間分解検出
SPADアレイモジュールPDA-23は、Luminosa顕微鏡にただ追加するだけではありません。
時間分解共焦点蛍光顕微鏡の可能性を大きく広げる画期的なアップグレードを実現します。
| 高解像度と高コントラストの機能イメージング イメージ走査型顕微鏡(ISM)の解像度の向上とコントラストの向上と FLIMの機能的情報を組み合わせることができます。 | シームレスな統合 Luminosa専用に設計され、完璧な互換性、最適化された性能を実現。 合理化された自動アライメントを搭載し、堅牢な日々の取り扱いが可能になります。 |
| カスタマイズ可能な研究ツール オープンなハードウェアと(.ptu)データフォーマットを活用して、 時分割光子検出における25年の経験に裏打ちされた信頼性で、 研究目標に合わせた新しい時分割手法を作成し、適用することが可能です。 イメージングからゆらぎ解析、単一分子蛍光モダリティまで SPADアレイにてを研究が可能です。 | 精度と互換性の融合 PDA-23検出器は、PicoQuant社のMultiHarp 160 TCSPCモジュールと完全に適合します。 PDA-23
MultiHarp 160
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ISMとFLIMの相乗効果を体験してください
ISMの利点
ISM-FLIM用Luminosaソフトウェアの機能
メタボリック・イメージングのための使いやすい内蔵フェムト秒レーザー
メリット
- FLIMによるNAD(H)活性の代謝イメージングモニター用
- 780nmのTOPTICA製フェムト秒ファイバーレーザー
- Luminosaへの結合とレーザー出力制御用光学部品
- カスタマイズされたワークフローへのソフトウェア統合
アドオンには以下が含まれます
出力ポート: 外部検出ユニットの結合
メリット
- 外部検出器、分光器のカップリング用
- ファイバーカップリングまたはフリースペースカップリング光学系
- カスタマイズされたワークフローへのソフトウェア統合
- 内部検出器と並行して使用可能
- 単一分子検出CCDカメラ付き分光器の追加
- FlexWaveのようなチューナブルフィルターを備えた検出器ユニットの追加
- 超伝導ナノワイヤー単一光子検出器の追加
アドオン
使用例
ステージトップインキュベーター：拡張生細胞
メリット
Tokai Hitより
- サンプルチャンバー＋対物レンズヒーター＋温度・CO2コントローラー
- サンプルホルダー＋ウェルプレート、皿、スライドなどの蓋
- フィードバック制御（オプション）
- ソフトウェア（Luminosaソフトウェアとの統合は不可）
Luminosa システム概要
Luminosa ソフトウェアの概要と特長
新しいソフトウェアコンセプトにより、使いやすさと信頼性が向上
- GPUアクセラレーションアルゴリズムにより、最小限のユーザー操作で迅速な結果が得られる。
- FCS、FLIM、単一分子検出のためのコンテキストベースのワークフロー
Luminosaソフトウェアは、単一分子検出、FCS、時間分解イメージングメソッドに加え、カスタム測定と分析モードを柔軟に定義することが可能です。また、迅速で簡単な実験ワークフローを可能にする設計により、サンプルの分析に集中することができます。各アプリケーションに関連するパラメータのみを表示するわかりやすいインターフェースにより、再現性の高い測定が可能になり、一貫性のあるデータセットが取得できます。
使用する蛍光色素を選択するだけで、励起レーザー、ビームパス、検出をソフトウェアが自動的に設定します。レーザー繰り返し周波数やパルスインターリーブ励起など、時間分解測定に重要なパラメーターの設定もソフトウェアが行います。取得中のデータをオンラインでプレビューできるため、ユーザーはサンプルとデータの品質を即座に確認でき、貴重な測定時間を節約することが可能です。GPUベースの高速解析ルーチンにより、ユーザーはすぐにデータを調べること も可能です。
Luminosa ソフトウェアのメリット
 |  |
| レーザーセッティング画面 | FLIM画面 |
- 倒立顕微鏡をベースにしたソフトウェア制御の共焦点システム
- 375～1064 nmのレーザー波長による汎用的な励起システム
- VarPSF：FCSおよび単一分子FRET実験のための観察量の微調整が可能
- 透過型およびFLIMモードでの “タイリング＆スティッチング “に対応した電動位置決めテーブル
- スキャンオプション：FLIMBeeガルボスキャナーおよびピエゾ対物レンズのスキャニング
- SPADおよび/またはハイブリッドPMTを用いた最大6つの並列検出チャンネル
- 各チャンネルで700ps未満のデッドタイムと5psのタイムビンを設定可能
- ワンクリックで自動アライメントでき、一貫した最適な性能を提供できます。
- FCS、FLIM、単一分子検出のためのGPU高速化アルゴリズムと、コンテキスト‐ベースのワークフローにより最小限でのユーザー操作で、迅速に測定結果を出すことが可能
Luminosa の各測定に対するソフトウェアの特長とメリット
各測定に関する詳細動画はこちら（外部英文ページ）よりご覧いただけます。
InstaFLIM
- 最小限のユーザー操作で高速解析
- 4つの異なる解析ルーチンを並行して実行：多重指数減衰フィット、位相プロット、パターンマッチング、寿命ヒストグラム
- FLIM種分離の提案
- パラメータの微調整が可能
InstaFCS
- 自己相関曲線と相互相関曲線のライブ計算
- モデルとパラメータの自動提案によるオンラインFCSフィッティング
- 相関曲線の標準偏差を含む
FRETcompass
- 効率対化学量論ヒストグラムのオンラインプレビュー
- 1分子FRET実験で使用される補正係数の自動決定
- 全チャンネルにおけるドナーのみ、低FRETおよび高FRET集団の蛍光寿命減衰
※2018年に発表されたコミュニティのベンチマーク研究に基づく論文
LumiFinder
- 固定化エミッターの自動検出と測定
- 単一分子研究、特に単一分子FRET測定用
- 調整可能な選択基準による固定化エミッターの局在化
- 定義可能なデュラクションで、特定位置でのポイント測定
- 各ポイントで取得したデータのオンラインプレビュー
Luminosa ハードウェアとソフトウェアの一体化強化により新機能の例
Luminosaのよる大きなサンプルのイメージング
- スパイラルスキャン：DIC、落射照明、または透過モードで、数mm²の大面積サンプルをわずか数秒で概観できます。
- リファレンスマップ：選択した領域や注目点でのさらなる測定のために、それらの空間的関係を解析用に保存します。
- 矩形領域のタイリングとスティッチング
- ホールドフォーカス機能
サンプルフリーのオートアライメント
- 最も困難な測定でも、すべての測定で最適なパフォーマンスを保証
- ワンクリックで一貫性
キャリブレーション励起（CalEx）
- 励起レーザーパワーのキャリブレーションにより、μW単位で励起強度を設定・表示可能
- 外部パワーメーター不要
可変PSF (VarPSF)
- 回折限界と大観察体積の切り替え
- FCSおよび1分子FRET実験用
- カスタマイズモードによるスポット変動FCS測定
最新鋭のハードウェア
- 倒立顕微鏡をベースとした共焦点システム
- 375～1064nmのレーザー波長による多彩な励起システム
- スキャニングオプション FLIMBeeガルボスキャナーおよびピエゾ対物レンズスキャン（イメージングのためのスピードまたは単一分子研究のための最高感度）
- SPADおよび/またはハイブリッドPMTによる最大6チャンネルの並列検出
- チャンネルあたり700 ps未満のデッドタイムと5 psのタイムビン
Luminosaはライフタイム領域で最高のパフォーマンスを発揮するように設計されている。さらに、この顕微鏡は同時に単一光子感度にも最適化されており、単一分子レベルでの実験が可能である。PicoQuant社の既存の共焦点MicroTime 200システムでの経験が、新しい顕微鏡の光学設計に反映され、最適なハードウェアコンポーネントの選択の指針となった。光学設計は、最小限の光学素子のみを最高の品質で組み込むことにより、最高の感度が得られるように最適化されています。さらに、ユーザーは、高速のためにガルボスキャナーを選択することも、ボタンをクリックするだけでガルボスキャナーをバイパスし、代わりにピエゾ対物スキャナーを使用することもできます。このオプションは他の共焦点顕微鏡にはありません。ピエゾスキャンはスキャンミラーでの信号のロスを防ぐため、波長に応じて約20～30％多くの光子を得ることができます。
Luminosaは最新世代のPMAハイブリッドディテクターとTCSPC電子回路を搭載し、時間分解測定とrapidFLIMHiResを実現しています。MultiHarp TCSPCモジュールのわずか650psという超短デッドタイムを利用することによ り、最大78Mcpsの光子カウントレートを維持することができます。ガルボスキャナーの速度、画像サイズ、サンプルの明るさにもよりますが、1秒間に最大15フレームのFLIM画像を取得することができます。
