広視野顕微鏡を用いた金属誘起エネルギー移動の研究

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金属誘起エネルギー移動 (MIET) は、蛍光分子から金属薄膜までの距離を測定するナノレベルの顕微鏡技術です。ここでは、LINCamを搭載した広視野およびTIRF蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)を用いたMIETの取得について紹介します。

フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)は、励起されたドナー分子がアクセプター分子にエネルギーを移動させるものです。MIET技術では、金属プラズモン表面がアクセプターとして働き、ナノメートルの精度で距離を測定することができます。図に一般的なMIETのセットアップを示します。カバースリップの金薄膜は、試料の発色団の蛍光を効率的に消光することで、エネルギー受容体として機能しますする。エネルギー移動の効率は分子と表面との距離に依存し、発色団が金薄膜に近いほど移動の確率は高くなります。
 
 

広視野顕微鏡を用いた金属誘起エネルギー移動の研究1

図1

 
 

固定細胞測定

GFPマーク付きプロテインキナーゼ(GFP-Lck)でトランスフェクトされたTリンパ球は、金でコーティングされたカバースリップに固定されました。最初に、測定は、励起波長488nmの標準的な落射蛍光照明条件下で行いました。その結果、強度加重平均寿命(図2a)および強度(図2c)画像は、接触部位でわずかに消光するGFPの典型的な寿命とグレイバリューの範囲を示した。同じ細胞の2回目の測定をTIRF照明で行ったところ、MIET効果に関連した、より高い寿命コントラスト(図2b)が示されました。
 
蛍光寿命成分を識別するために、最大エントロピー法(MEM)解析を行いました(図4)。MEM解析に基づき、画素ごとの振幅フィッティングを行った結果を図3に示します。
 
0,38ナノ秒と0,82ナノ秒の寿命成分に対応する振幅を合計し、強度画像(Fig.3c)と振幅加重寿命マップ(Fig.3a)を作成しました。他の2つの成分、2,29 nsと5,58 nsの結果も示している(図3b、3d)。短成分画像は、T細胞受容体刺激後の細胞膜に沿ったプロテインキナーゼの典型的なクラスター化を示しています。
 
 

広視野顕微鏡を用いた金属誘起エネルギー移動の研究2
 
図2

広視野顕微鏡を用いた金属誘起エネルギー移動の研究3
 
図3

 
 

広視野顕微鏡を用いた金属誘起エネルギー移動の研究4

図4

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